心肌细胞在缺氧损伤之后,其形态及功能都会发生很大变化,细胞膜的破损是心肌细胞损伤的一个重要表现。细胞凋亡时,线粒体△ψm下降,说明细胞内膜结构发生改变,膜通透性增加。最近的研究发现,地奥心血康能够提高受损心肌细胞的线粒体△ψm。
天津医科大学药理教研室将Wistar新生大鼠(1—3天)的心肌细胞进行分离,然后分为5组:C组(为对照组):实验时更换无血清培基,置CO2培养箱内孵育24小时,然后用复氧液漂洗细胞2次,加入复氧液置培养箱3小时后,再换复氧液孵育2小时;A/R组(缺氧/复氧组):采用Koyama等方法建立缺氧/复氧模型,实验时弃去原培养液,用缺氧液漂洗细胞2次,换高浓度氮气饱和的缺氧液,培养板置于95%N/5%CO2持续通气的缺氧密闭容器中(37℃)3小时,再换预先用纯氧饱和的复氧液,以95%O2/5%CO2进行复氧孵育2小时;地奥心血康低、中、高剂量干预组:缺氧/复氧前用终浓度分别为10、20、40mol/ml的地奥心血康与细胞共同孵育30 分钟,其他操作同A/R组。
观察指标:①心肌细胞搏动率及细胞形态学变化;②心肌细胞存活率;③心肌细胞线粒体膜电位△ψm)变化和细胞[Ca+]i水平变化。
结 果
各组心肌细胞博动频率和存活率
培养的心肌细胞形态为梭形、星形或三角形,C组心肌细胞同步节律性自发搏动频率为90~120beat/min,节律规则,收缩有力;A/R组心肌细胞搏动频率减慢,幅度减弱,节律不齐,部分停搏;地奥心血康干预的各剂量组与A/R组比较搏动明显增强而规则。A/R组心肌细胞严重受损,细胞存活率较C组显著降低,地奥心血康干预的各剂量组心肌细胞受损较A/R组明显减轻,差异有统计学意义(P<0.01),见表1。
各组心肌细胞线粒体膜电位和细胞[Ca+]i水平变化
A/R组缺氧/复氧损伤后心肌细胞线粒体△ψm明显下降,[Ca+]i显著升高;地奥心血康干预使降低的线粒体△ψm显著升高(P<0.01),[Ca+]i超载明显减轻(P<0.01)。
本实验A/R组心肌细胞线粒体Rh123荧光强度明显下降,提示A/R组线粒体损伤,导致△ψm下降;单独给予地奥心血康,线粒体Rh123荧光强度有轻微下降,但与C组比较没有显著性差异,表明地奥心血康对正常心肌细胞△ψm几乎无影响;与A/R组比较,地奥心血康干预组△ψm明显升高,提示地奥心血康对线粒体功能具有保护作用。
诱导细胞凋亡的因素很多,在心肌缺氧/复氧损伤引起的细胞凋亡,主要机制可能为自由基增多和[Ca+]i水平升高。本实验以荧光强度间接代表细胞内的平均[Ca+]i水平,经荧光强度统计分析后发现,地奥心血康干预组[Ca+]i荧光强度比A/R组显著降低,反映复氧后的钙超载减轻。
本实验证实了心肌细胞在发生缺氧/复氧损伤后,△ψm明显下降,说明细胞调亡发生与△ψm降低有关。地奥心血康能使△ψm显著升高,表明它可以减轻缺氧/复氧对心肌细胞的损伤,其作用机制之一可能是通过保护线粒体膜实现。细胞凋亡的发生也与[Ca+]i超载相关,地奥心血康能使复氧后细胞的[Ca+]i超载减轻,可使凋亡受到抑制,对A/R损伤的心肌细胞发挥重要的保护作用。